流动注射分析测定十七合氨基酸输液中

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流动注射分析测定十七合氨基酸输液中

十七合氨基酸输液是由17种氨基酸加辅料组成。对复合氨基酸含量的测定常采用氨基酸分析仪或HPLC进行。由于乙酰半胱氨酸在混合液中含量较少，这些仪器测定此化合物的灵敏度较低。经研究，发现该化合物与亚硝基铁氰化钠的碱性溶液反应生成红色化合物，但此生成物不稳定。我们沈阳第一制药厂药物研究所采用流动注射液分析(flowinjectionanalysis，FIA)样品处理技术，利用该不稳定显色反应进行定量分析，对十七合氨基酸输液中乙酰半胱氨酸的含量进行测定，结果很好。目前这一分析方法，未见国内外有报道。

1　实验部分
1.1　仪器和试剂　WFZ800-D₃紫外可见分光光度计(北京第二光学仪器厂)；LZ-1100组合式FIA分析仪(沈阳电影反光镜厂)；HP3390A自动积分记录仪(美国惠普公司)；HPLC分析仪(美国Waters公司)。乙酰半胱氨酸等17种氨基酸(日本进口，符合药用标准)；十七合氨基酸输液(本所水针室提供)；其它试剂均为分析纯。
1.2　溶液配制方法　准确称取亚硝基铁氰化钠(含2个结晶水)10g，用0.01mol/L氢氧化钠溶液溶解至500ml，得到显色剂(0.02g/ml)。实验中缓冲液为pH=12，配制方法参见文献。
1.3　FIA流路及操作方法
1.3.1　FIA流路　见图1。

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A—显色剂；B—缓冲液；S—试样；P—蠕动泵；V—自动进样阀；
M—反应盘管；D—流通池(18μl)；I—记录仪；W—废液
　　图1　FIA流路图

1.3.2　操作方法　按FIA流路安装好仪器，先启动蠕动泵，再启动分光光度计，预热5min。将显色剂和缓冲液分别(1∶1)通入流路中；待基线稳定后注入试液，在525nm波长下测定，记录峰高信号。根据峰高与试液浓度成正比对乙酰半胱氨酸进行定量分析。
1.4　实验条件
1.4.1　最大吸收波长的确定　在500～600nm波长内间隔5nm连续改变波长，分别注入同一乙酰半胱氨酸标准液，得到不同波长下的吸收峰，结果表明，525nm处峰高最大，故选择其为测定波长，见图2(实验中波长精确度为0.5nm)。

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图2　波长与峰高关系曲线

1.4.2　线性关系考查　向FIA流路中分别注入不同浓度的乙酰半胱氨酸标准液，测得浓度与峰高的关系。结果表明，乙酰半胱氨酸浓度在(40～200)×10^-6g/ml内与峰高的线性方程为：Y=5.17×10⁴X-1.84×10⁶，r=0.9991，(n=5)。
1.4.3　FIA其它条件实验结果　反应盘管长度1.1m；注样体积30μl；显色剂和缓冲液总流速3.6ml/min。
1.5　回收率实验　按照十七合氨基酸输液的处方量准确称取17种氨基酸，加入山梨醇等辅料，制成模拟样品。用FIA法测定乙酰半胱氨酸含量，得平均回收率为99.14%，RSD=1.3%(n=5)。
1.6　样品的测定　精密量取十七合氨基酸注射液5.0ml，置25ml量瓶中，用缓冲液稀释至刻度，摇匀。在选定的实验条件下，以单组分的乙酰半胱氨酸为对照液，测定样品中的乙酰半胱氨酸含量。
　　用HPLC测定相同样品，两者测定结果一致，见附表。

附表　样品测定结果(mg/100ml)

批号	FIA法	HPLC法	批号	FIA法	HPLC法
91306	39.9	40.7	91503	28.5	30.0
91308	57.2	54.9	91602	51.6	53.4
91501	37.9	39.2

2　讨　论
　　本实验以亚硝基铁氰化钠为显色剂，在酸性介质中，乙酰半胱氨酸与此显色剂没有颜色反应；在碱性介质中，亚硝基铁氰化钠溶液开始为暗红色，几分钟后变为褐绿色，并能稳定存在，3d内对测定没影响。乙酰半胱氨酸与此显色剂反应生成红色化合物，但此生成物不稳定，颜色很快减弱。当FIA流路中乙酰半胱氨酸与显色剂反应产物的最高浓度点流经检测器时，使溶液停止流动，观察检测信号(溶液吸收度)随时间变化，见图3。

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图3　吸收度与时间关系S—停流点

　　实验结果表明，样品与显色剂反应经反应盘管到达检测器时，化学反应并没停止，化学反应一直处于动态变化之中。此不稳定反应用常规比色法是不可能的，只有利用FIA技术，才能使其进行定量分析。
　　本实验中，FIA测定速率为180次/h；连续测定的稳定性为RSD=0.44%(n=9)；化学反应在室温下进行。本方法具有线性范围宽，操作简单，分析成本低等优点。在测定乙酰半胱氨酸上可以成为氨基酸分析仪等高档仪器的补充。
　　半胱氨酸类氨基酸，由于巯基的存在，易被氧化，在输液中常做抗氧剂；在其测定过程中，样品稀释后应在短时间内完成测定。